在完成標準品和樣本的加樣后，需立即覆蓋封板膜，輕輕震蕩混勻30秒，確保反應液充分接觸孔內包被的抗體。隨后將酶標板置于37℃恒溫孵育箱中，避光孵育60分鐘。此步驟的關(guān)鍵在于溫度與時(shí)間的精準控制，避免因環(huán)境波動(dòng)導致非特異性結合。

孵育結束后，小心揭開(kāi)封板膜，甩盡孔內液體，每孔加入350μL預冷的洗滌緩沖液（1×PBS），靜置30秒后棄去。重復洗滌4次，最后一次需在吸水紙上拍干，確保無(wú)殘留液體。注意動(dòng)作輕柔，避免交叉污染或孔壁劃傷。

   接下來(lái)，每孔依次加入50μL辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的二抗工作液，再次覆蓋封板膜，37℃孵育30分鐘。此階段需避光操作，防止酶活性衰減。二抗孵育完成后，重復上述洗滌步驟5次，去除未結合的酶標抗體。

顯色反應是檢測的核心環(huán)節。每孔加入現配的TMB底物溶液100μL，室溫避光孵育15-20分鐘。當標準品孔呈現明顯的藍色梯度變化時(shí)，立即加入50μL終止液（2M硫酸），溶液轉為黃色后，于450nm波長(cháng)下測定各孔OD值。若使用雙波長(cháng)校正，需同步讀取630nm參比數據以減少干擾。

   最后，以標準品濃度為橫坐標、OD值為縱坐標，繪制四參數邏輯曲線(xiàn)（4PL）擬合標準曲線(xiàn)，計算樣本中5-HT含量。若樣本OD值超出線(xiàn)性范圍，建議用稀釋液調整后復測。整個(gè)流程需在6小時(shí)內完成，以保證試劑穩定性。實(shí)驗結束后，妥善處理廢棄酶標板及液體，避免生物污染。

注意事項：

1. 所有試劑使用前需平衡至室溫，避免反復凍融；

2. 加樣時(shí)槍頭避免觸碰孔壁，防止交叉污染；

3. 顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)可能導致背景偏高，需嚴格控制反應時(shí)長(cháng)。